附录2　冻干人凝血酶原复合物效价测定法

1　试剂

1.1标准血浆

用3.8%枸橼酸三钠作抗凝剂，按1∶10比例采集全血（1份抗凝剂+9份全血）。4℃2000r/min离心20分钟，分离血浆。取30份新鲜正常人血浆等量混合后，分装于小塑料管内（0.5ml/支）。置-30℃冰箱保存备用。从采血到血浆冻结完毕不超过4小时。用时在37℃水浴中融化，然后置冰浴中备用，亦可制成冻干品。

1.2　基质血浆

用1.34%草酸钠人和抗凝剂，按1∶10比例采集健康人血（1份草酸钠+9份全血）10℃以下2000r/min离心20分钟，分离血浆，然后按10%（W/V）加入BaSO4，在37℃水浴内搅拦吸附15分钟，10℃以下2000r/min离心30分钟，取上清分装（3ml/支）。-30℃保存备用。从采血到血浆冻结不超过6小时。使用时在37℃水浴中融化，然后置冰浴中备用。

1.3　凝血活酶溶液

取干兔脑粉120mg，加2ml生理盐水，加0.1ml1.34%草酸钠溶液，放入45～50℃水浴中搅拌15分钟，2000r/min离心5分钟，取上清液置冰浴中备用。当日配制当日使用，或存放于-30℃1个月内使用。

1.40.025mol/LCaCl2溶液

称2.775g无水氯化钙（分子量110.98，AR），加水溶解至1000ml。

1.5　稀释液

生理盐水调pH7.4，再加白蛋白使最终浓度为0.2%。

2　测定

2.1空白

取10×75mm试管2支，每管加0.1ml稀释液，0.1ml基质血浆，0.1ml凝血活酶，然后置37℃水浴中保温1分钟，再加0.1ml37℃预热的0.025mol　/LCaCl2溶液，记录CaCl2加入至纤维蛋白形成的时间，应大于3分钟。

2.2标准曲线的准备

用稀释液将标准血浆作1∶2至1∶32的2倍系列稀释，然后取不同稀释度的标准血浆0.1ml代替空白稀释液，其他按空白测定过程和要求进行，两管测定结果相对误差应≤10%。

2.3　样品测定

用稀释液将样品作适当的2个稀释度（使凝固时间落于标准曲线内），然后取不同稀释度的样品0.1ml，代替空白稀释液，其他按空白测定过程和要求进行。

2.4结果计算

用回归方程计算：将不同稀释度的标准血浆凝固时间（秒）和稀释度的对数值输入到科计算器，得到一条标准曲线，r值应大于0.97。然后将稀释样品的凝固时间的对数分别输入到计算器内，得到相应的标准血浆的稀释倍数，用样品的稀释倍数除以相应的标准血浆的稀释倍数即为凝血酶原复合物的效价单位/ml（每一单位相当于1ml正常人血浆血液凝固因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的活性）。取样品两个稀释度的效价单位的均值为本样品效价单位/ml。