短棒状杆菌菌苗制造及检定规程

本品系用具有免疫调节及抑瘤等活性的厌氧棒状杆菌经培养后制成悬液，加甲醛杀菌，以无菌缓冲生理盐水稀释而成。用于恶性肿瘤及其他疾病的免疫治疗。

1　菌种

1.1　菌种来源

制造菌苗用的菌种采用厌氧短棒状杆菌H75010或其他经试验证明安全有效的菌株。生产用菌种和检定用血清，由中国药品生物制品检定所分发或经同意。

1.2　菌种检定

1.2.1　培养特性

检定菌种用碎肉半流体、肝硫乙醇酸钠培养基或其他适宜培养基。本菌应为革兰氏阳性短棒状菌，有异染颗粒。

1.2.2　生化反应

应发酵葡萄糖，不发酵棉子糖、麦芽糖、蔗糖，液化明胶，靛基质、硝酸盐反应阳性。

1.2.3　血清学试验

应属Ⅰ型。Ⅰ型血清由中国药品生物制品检定所供应或经同意。

1.2.4　脾激活试验

用体重18～20g纯种小白鼠（C[XB]3[/XB]H、615或C57BL），试验及对照各10只，雌雄各半。试验组每只腹腔注射菌液0.5ml（15亿菌），对照组注射同量生理盐水，14天处死小白鼠，分别称体重、脾重、计算脾指数，其指数应不低于2.0。

脾指数=试验组脾重（mg）/总体重（g）÷对照组总脾重（mg）/总体重（g）

1.2.5　抑瘤试验（艾氏腹水癌）

用体重18～20g纯种小白鼠（C3H、615、C57BL或K-LACA），试验及对照组各10只。雌雄各半，每只腹腔注射活的瘤细胞100万/0.2ml（用传代5～8天非血性腹水）。试验组于注射瘤细胞前1天及攻瘤后次日起，连续腹腔注射菌液0.25ml（15亿）3～5次，每次间隔1天，对照组同时注射同量生理盐水，由对照组小白鼠全部因癌性腹水死亡起点计算试验组小白鼠存活率，观察期最长30天，其存活率应不低于70%。

1.2.6　毒性试验

小白鼠及分组要求同1.2.4项，称总体重，试验组每只小白鼠腹腔注射0.5ml菌液（15亿），对照组注射同量生理盐水，观察1周，到期称总体重，不得较试验前减轻或死亡。

1.3　菌种保存

菌种应冻干，置2～8℃保存。

2　菌苗制造

2.1　制造用培养基

可用蛋白胨、肝或酵母透析液培养基或其他适宜培养基。

2.2　原液制造

2.2.1　接种

连续2～4次传代的种子液接种于大瓶或培养罐，36～37℃厌氧培养4～6天。

2.2.2　采集

到期之培养物采集前逐瓶或逐罐镜检，有杂菌污染者废弃。

2.2.3　杀菌

采集之菌体加入不超过0.5%(ml/ml)甲醛溶液，杀菌48小时后进行无菌试验，不得有任何菌生长。

2.2.4　菌液洗涤

无菌试验合格的菌液经离心沉淀后，用新鲜无菌生理盐水洗涤3次，其最后一次用无菌生理盐水做成悬液，加温60～65℃1小时，逐瓶做无菌试验，合格后合并。

2.2.5　原液合并

无菌试验合格的菌液合并成批，放2～8℃保存。

2.3　原液检定

2.3.1　镜检

菌形正常，至少观察10个视野，应无杂菌。

2.3.2　无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

2.3.3　浓度测定

按中国细菌浊度标准测定。

2.3.4　毒性试验

按1.2.6项进行。

2.3.5　脾激活试验

除脾指数应不低于1.5个，余同1.2.4项。

2.3.6　抑瘤试验

同1.2.5项。样品应先按2.6项加温处理。

2.4　菌液稀释

2.4.1　稀释

根据2.3.3项测定的原液浓度用无菌磷酸盐缓冲液生理盐水（pH7.2～7.4）稀释成每ml含菌体60亿±的菌苗。

2.4.2　分批

同一天由同一批原液稀释的菌苗作为1批，如1批有数瓶，应分亚批。

2.4.3　检定

稀释的菌苗应逐瓶做无菌试验。

2.5　分装

经2.4.3项检定合格的菌苗在充分摇匀下分装。

2.6　加热处理

分装安瓿后立即60℃±2℃加热30分钟。

3　成品检定

3.1　理化检定

菌苗应为乳白色悬液，pH6.6～7.2，无异味，无摇不散的菌块及异物。

甲醛含量不得超过0.006%（ml/ml）。

3.2　无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

3.3　脾激活试验

按2.3.5项进行

3.4　抑瘤试验

按1.2.5项进行（检定合格的原液在半年内分装者，成品可不再作3.3～3.5项检定）。

3.　5　浓度测定

按2.3.3项测定，每ml应含菌体60亿±10%。

3.6　安全试验

用18～20g白小鼠5只，每只皮下注射菌苗0.5ml，观察7日，不得有局部脓肿或死亡。

4　保存与效期

应保存于2～8℃。自原液采集之日起效期为2年半。