第四节 非酯化脂肪酸测定
临床上将C[XB]10[/XB]以上的脂肪酸称为游离脂肪酸（free fatty acid,FFA）或非酯化脂肪酸（nonesterifiedfatty acid,NFFA），正常血清中含有油酸（18:1,W[SB]9[/SB]）占54%，软脂酸（16：0）占34%，硬脂酸（18：0）占6%，是其主要的NFFA。另外还有月桂酸（12：0）、肉豆蔻酸（14：0）和花生四烯酸（20：4，W[SB]6[/SB][SB]，9，12，15[/SB]）等含量很少的脂肪酸。与其他脂质比较，NFFA在血中浓度很低，其含量水平极易受脂代谢，糖代谢和内分泌机能等因素影响，血中NFFA半寿期为1～2min，极短。血清中的NFFA是与清蛋白结合进行运输，属于一种极简单的脂蛋白。
测定血清NFFA法有滴定法。比色法，原子分光光度法，高压液相层析法和酶法等。一般多以酶法测定。作NFFA测定的标本一定要注意在4℃条件下分离血清并尽快进行测定。因为血中有各种脂肪酶存在，极易也极快使血中TG和PL的酯型脂肪酸分解成非酯化的FFA，使血中NFFA值上升。贮存标本仅限于24h内，若保存三天，其值约升高30%，使结果不准确。
1．非酶法测定
非酶法测定包括滴定法、比色法、原子吸收分光光度法和高压液相层析法。前三种方法准确性差；高压液相层析法，仪器太昂贵，不便于批量操作。
2．酶测定法
主要用脂肪酶测定。血清中游离脂肪酸可分别测定酶水解后的产物乙酰CoA或AMP或辅酶A（CoA）进行定量。酶法测定结果准确可靠，快速，易于批量检测。测定原理如图15-6所示。
图15-6 血清主要FFA酶法测定图
□：内物质作为生成量与变化量进行测定；ACS：乙酰CoA合成酶；MK：肌激酶； PK：丙酮酸激酶；POD：丙酮酸氧化酶；DTNB：α-磺基苯甲酸；ACO：乙酰CoA氧化酶；ACD：乙酰CoA脱氢酶。
一、亮度法
1．原理
血清中游离脂肪酸经抽提到高密度铜试剂中，形成铜皂在上层溶剂中，再用二苯卡巴肼与铜显色，进行定量。
2．试剂组成
| 代号 | 种类 | 浓度 | 组成 | 贮存2～8℃ | 有效期 |
| R-1 | 抽提剂 | 氯仿：庚烷：甲醇=5：5：1（V/V） | |||
| R-2 | 缓冲液 | 33mmol/L | KH[XB]2[/XB]PO[XB]4[/XB]4.539g/L 100ml+Na[XB]2[/XB]HPO[XB]4[/XB]·2H[XB]2[/XB]O5.983g/l 50ml调pH至6.4 | ||
| R-3 | 铜贮液 | 500mmol/L | Cu（NO[XB]3[/XB]）[XB]2[/XB]·3H[XB]2[/XB]o 12.07g加H[XB]2[/XB]O→100ml | ||
| R-4 | 三乙醇胺 | 1.0mol/L | 三乙醇胺10ml，加水→100ml | ||
| R-5 | NaOH液 | 1mol/L | |||
| R-6 | 铜试剂 | R-3 10ml+R-4 10ml+R-6 6ml +H[XB]2[/XB]O→100ml调pH至8.1 | |||
| R-7 | 二苯卡 巴肼液 | 二苯卡巴肼（乙醇）液（4g/L）10ml+R-4 0.1ml | 临用前配制 | ||
| R-8 | 软脂酸标准贮存液 | 2mmol/L | 软脂酸51.2mg溶于100ml R-1液 | 冷藏 | |
| R-9 | R-8的应用液 | 500μmol/L | 用R-1液稀释 | 冷藏 |
3．操作
按图15-7操作。
4．计算
血清游离脂肪酸（μmol/L）=E[XB]SA[/XB]/E[XB]ST[/XB]×500
二、酶法
1．原理
血清中游离脂肪酸或非酯化脂肪酸（NEFA），经酶试剂作用生成紫色化合物，其颜色深浅与NEFA含量成正比。
2．试剂组成
| 代号 | 种类 | 组成 | 浓度贮存 | 贮存 |
| R1 | 缓冲液 | 磷酸缓冲液 MgCl[XB]2[/XB]液 去垢剂 | 0.04mmol/LpH6.9 3mol/L | |
| R2 | 酶/辅酶 | 乙酰CoA合成酶 抗坏血酸氧化酶 CoA ATP 4-AAP 溶于10ml R1液中 | ≥0.3U/ml ≥1.5U/ml 0.9mmol/L 5.0mmol/L 1.5mmol/L | 冷藏5日 |
| R3 | 酶稀释液 | 苯氧乙醇 去垢剂 | 0.3%(V/V) | |
| R4 | 马来酰亚胺 该试剂与R3等体积混合 | 10.6mmol/L | ||
| R5 | 酶试剂 | 乙酰CoA氧化酶 过氧化物酶 TOOS 混合上述试剂，再等体积R4试剂混合 | ≥10U/ml 7.5U/ml 0.2mmol/L | 冷藏5日 |
| R6 | 标准液 | 1mmol/L | 冷藏 |
*应用带玻塞离心管
3．操作
按图15-8操作。
4．计算
图15-7 血清非酯化脂肪酸测定(光度法)操作图
图15-8 血清非脂化脂肪酸测定（酶法）操作图
（胡汉宁 储建中）