第二节　PCR技术的原理

PCR是体外酶促合成特异DNA片段的新方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2[SB]n[/SB]的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增10[SB]9[/SB]倍以上，实际上一般可达10[SB]6[/SB]～10[SB]7[/SB]倍。

图22-1　PCR基本原理示意图

假设扩增效率为“X”，循环数为“n”，则二者与扩增倍数“y”的关系式可表示为：y=(1+X)[SB]n[/SB]。扩增30个循环即n=30时，若X=100%，则y=2[SB]30[/SB]=1073741824(>10[SB]9[/SB])；而若X=80%时，则y=1.8[SB]30[/SB]=45517159.6(>10[SB]7[/SB])。由此可见，其扩增的倍数是巨大的，将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外灶照射下（254nm）一般都可见到DNA的特异扩增区带。